HVBO|| SNP 基因分型有哪些方法？
SNP，全稱 Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入，形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。從理論上來看每一個(gè) SNP 位點(diǎn)都可以有 4 種不同的變異形式, 但實(shí)際上發(fā)生的只有兩種, 即轉(zhuǎn)換和顛換, 二者之比為 2：1。SNP 在 CG 序列上出現(xiàn)最為頻繁, 而且多是 C 轉(zhuǎn)換為 T , 原因是 CG 中的胞嘧啶常被甲基化, 而后自發(fā)地脫氨成為胸腺嘧啶。
一般而言,SNP 是指變異頻率大于 1 % 的單核苷酸變異。在人類基因組中大概每 1000 個(gè)堿基就有一個(gè) SNP , 人類基因組上的 SNP 總量大概是 3 ×10^6 個(gè) 。因此,SNP 成為第三代遺傳標(biāo)志, 人體許多表型差異、對(duì)藥物或疾病的易感性等等都可能與 SNP 有關(guān)。
SNP 根據(jù)其在基因中的位置，可以分為基因編碼區(qū)、基因非編碼區(qū)、基因間隔區(qū)（基因之間的區(qū)域）。由于基因序列的兼并性，編碼序列中的 SNP 不一定會(huì)改變蛋白的氨基酸序列。編碼區(qū)的 SNP 有兩種類型: 同義和非同義。同義單核苷酸多態(tài)性并不影響蛋白質(zhì)序列，而非同義的則會(huì)改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
而不在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的 SNP 仍可能影響基因剪接、轉(zhuǎn)錄子結(jié)合、信使 RNA 降解或非編碼區(qū)的 RNA 序列。受到這種單核苷酸多態(tài)性（SNP）影響的基因表達(dá)被稱為單核苷酸多態(tài)性表達(dá)（ESNP），可能發(fā)生在此基因的上游或下游。
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直接測(cè)序法
目前很多老師在研究 SNP 位點(diǎn)的時(shí)候，仍然在選用直接測(cè)序法，Sanger 測(cè)序原理為雙脫氧終止法，會(huì)忠實(shí)的延伸出模板鏈上的堿基序列，在毛細(xì)管電泳中會(huì)依次收集各個(gè)堿基的熒光信號(hào)，SNP 則會(huì)在測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)如下套峰的情況，示例如下：
優(yōu)點(diǎn)：直接測(cè)序法是目前最直觀，準(zhǔn)確性相對(duì)而言最高的 SNP 分型方法，適用于發(fā)現(xiàn)未知 SNP 位點(diǎn)，檢測(cè)少量樣本，少量位點(diǎn)的堿基多態(tài)性。
缺點(diǎn)：通量太低，且成本較高，但是隨著現(xiàn)在高通量的測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，目的片段甚至全基因組的高通量測(cè)序也讓直接測(cè)序法重新煥發(fā)活力。
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片段長(zhǎng)度多態(tài)性法
RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）是一種較早的進(jìn)行 SNP 分型的技術(shù)，簡(jiǎn)單來說就是在包含 SNP 位點(diǎn)的序列中存在有特定的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，而 SNP 位點(diǎn)基因型的改變則會(huì)使該酶切位點(diǎn)失效，這樣根據(jù)酶切之后 PCR 片段長(zhǎng)度的多態(tài)性即可得知對(duì)應(yīng)的基因型，下面用一張圖片來示意該方法的實(shí)驗(yàn)流程：
如上圖所示，三種基因型的結(jié)果條帶數(shù)目不一致，可以比較容易判讀樣本的基因型。
優(yōu)點(diǎn)：適合小批量樣本的分型實(shí)驗(yàn)，不需要特殊的儀器，只需要一臺(tái) PCR 儀以及電泳儀器即可；
缺點(diǎn)：通量小且對(duì)于位點(diǎn)要求高（需要特定的酶切位點(diǎn)），且沒法兒準(zhǔn)確的鑒別假陽(yáng)性的情況（酶切不完全）。
針對(duì)上述情況，如果是沒找到合適的酶切位點(diǎn)，或者說存在的酶切位點(diǎn)所需要的內(nèi)切酶成本較高，可以通過在 PCR 引物上引入錯(cuò)配，得到理想的酶切位點(diǎn)；
其次，為了增大該種方法的檢測(cè)精確性，一種方法是在 PCR 產(chǎn)物中選擇一個(gè)內(nèi)參酶切位點(diǎn)（與目標(biāo)酶切位點(diǎn)一致，用以檢測(cè)酶切是否完全），第二種方法就是改進(jìn)出了熒光酶切方法，即在 PCR 的產(chǎn)物上添加上熒光，通過測(cè)序儀收集熒光信號(hào)，報(bào)告產(chǎn)物的長(zhǎng)度，該種方法的優(yōu)勢(shì)在于毛細(xì)管電泳的精確性更高，分辨率更大，同時(shí)可以混合上樣，降低實(shí)驗(yàn)分型的成本，提高效率。
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飛行質(zhì)譜法
基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)的 SNP 分型原理是：先通過 PCR 擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加入 SNP 序列特異延伸引物，在 SNP 位點(diǎn)上延伸 1 個(gè)堿基。將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管, 而后用瞬時(shí)納秒（10 - 9s）強(qiáng)激光激發(fā)，基質(zhì)分子吸收輻射能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，使基質(zhì)晶體升華，核酸分子就會(huì)解吸附并轉(zhuǎn)變?yōu)閬喎€(wěn)態(tài)離子，產(chǎn)生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場(chǎng)中獲得相同的動(dòng)能，進(jìn)而在一非電場(chǎng)漂移區(qū)內(nèi)按照其質(zhì)荷比率的不同得以分離，在真空小管中飛行到達(dá)檢測(cè)器。
MALDI 產(chǎn)生的離子常用飛行時(shí)間（Time-of-Flight，TOF）檢測(cè)器來檢測(cè)，離子質(zhì)量越小，就越快到達(dá)。利用質(zhì)譜分析對(duì)質(zhì)量的靈敏度特別高的特點(diǎn)，很容易將僅含有一個(gè)不同堿基的兩段基因序列區(qū)別開，推導(dǎo)出 SNP 分型。
優(yōu)點(diǎn)：成本較低，不需要合成特殊的熒光引物，只需要一對(duì) PCR 引物以及延伸引物即可；檢測(cè)方便，靈敏度高，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性有保證；
缺點(diǎn)：對(duì)于 SNP 位點(diǎn)兩側(cè)序列要求較高，存在特殊序列，如 SNP 位點(diǎn)，插入缺失等會(huì)影響準(zhǔn)確性，另外，對(duì)于樣本質(zhì)量稍微有些高，補(bǔ)數(shù)據(jù)較為麻煩，如果樣本質(zhì)量不是很好的，建議謹(jǐn)慎選用。
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Taqman 熒光探針法
Taqman 探針想必各位都不陌生，原理介紹如下：
該技術(shù)是由 ABI 研發(fā)的 SNP 分型技術(shù)，其技術(shù)原理如下：PCR 反應(yīng)時(shí)，加入一對(duì)兩端有不同熒光標(biāo)記的 MGB 特異探針來識(shí)別不同等位基因（allele1 和 allele2），5’端為報(bào)告熒光基團(tuán)（reporter），3’端為淬滅熒光基團(tuán) (quencher)。PCR 過程中，兩個(gè)探針能與正向引物和反向引物之間的互補(bǔ)序列特異退火結(jié)合。當(dāng)探針以完整形式存在時(shí)，由于能量共振轉(zhuǎn)移，熒光基團(tuán)只發(fā)出微弱熒光。
特異的探針與相應(yīng)的等位基因結(jié)合后，DNA 聚合酶發(fā)揮 5’到 3’外切酶活性，把報(bào)告熒光基團(tuán)切割下來，脫離 3’端淬滅熒光基團(tuán)的淬滅作用（quench），從而發(fā)出熒光。兩個(gè)探針的 5’端標(biāo)有不同的熒光（FAM 或 VIC），3’端標(biāo)有 MGB 淬滅基團(tuán)結(jié)合體。根據(jù)檢測(cè)到的不同熒光，可以判斷相應(yīng)樣本的 SNP 等位基因型。
上圖右側(cè)即為 Taqman 實(shí)驗(yàn)分型后的結(jié)果圖，以上，藍(lán)色和紅色代表兩種純合子，右上角的綠色則為雜合子，左下角的黑色為 NTC，其余地方散落的黑色的點(diǎn)則為由于樣本原因無法準(zhǔn)確分型的結(jié)果。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高，判讀也很方便，認(rèn)可度高；
缺點(diǎn)：探針合成耗時(shí)較長(zhǎng)，一般為 ABI 公司合成。
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多重 SNaPshot 檢測(cè)方法
SNaPshot 技術(shù)又稱為小測(cè)序技術(shù)，是由美國(guó)應(yīng)用生物公司 (ABI) 開發(fā)的主要針對(duì)中等通量 (<20) 的 SNP 分型項(xiàng)目的分型技術(shù)。既然叫小測(cè)序技術(shù)，那么他的原理就跟一代測(cè)序很類似了，在一個(gè)含有測(cè)序酶，四種熒光標(biāo)記的 ddNTP(注意：這里只有 ddNTP，并沒有測(cè)序反應(yīng)中的 dNTP），緊挨多態(tài)位點(diǎn) 5’端的不同長(zhǎng)度延伸引物和 PCR 產(chǎn)物模板的反應(yīng)體系中，引物延伸一個(gè)堿基即終止。
經(jīng) ABI 測(cè)序儀跑膠后，根據(jù)峰的顏色可知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型，針對(duì)不同的 SNP 位點(diǎn)設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的延伸引物來做到多個(gè) SNP 在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行分型。
SNaPshot 的原理圖如下：根據(jù)毛細(xì)管跑出來的峰的顏色區(qū)分一個(gè)樣本的單個(gè)位點(diǎn)的基因型，根據(jù)峰的位置區(qū)分位點(diǎn)。
優(yōu)點(diǎn)：方法靈活，位點(diǎn)選擇性不大，只要位點(diǎn)一側(cè)的序列符合設(shè)計(jì)測(cè)序引物的條件即可，對(duì)于插入缺失，同源區(qū)域等也有比較好的檢測(cè)方案可以設(shè)計(jì)。
缺點(diǎn)：價(jià)格比較高。
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LDR 連接酶檢測(cè)反應(yīng)法
LDR 法是基于核酸特異雜交原理，設(shè)計(jì)兩條 3' 端堿基不一樣的鑒別引物用以鑒別 SNP 位點(diǎn)的兩種 Allele，同時(shí)設(shè)計(jì)一條在位點(diǎn)另一側(cè)的通用的引物，在高溫連接酶的作用下，當(dāng)左右兩條寡核苷酸探針（鑒別引物以及通用引物）與目的 DNA 序列完全互補(bǔ)，并且兩條探針之間沒有空隙時(shí)才能發(fā)生連接反應(yīng)，通過溫控循環(huán)該特異性連接反應(yīng)可反復(fù)進(jìn)行，達(dá)到線性擴(kuò)增的效果，最后通過熒光掃描片段長(zhǎng)度（在通用引物的合成時(shí)已經(jīng)在一端進(jìn)行了熒光修飾），實(shí)現(xiàn)對(duì) SNP 位點(diǎn)的檢測(cè)。
原理圖如下，圖中可以看出同一個(gè)位點(diǎn)的兩個(gè) Allele 通過引物的長(zhǎng)度不同進(jìn)行了區(qū)分，不同的位點(diǎn)之間則是通過位置進(jìn)行的區(qū)分。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，無需特制的試劑，比較適合 10 個(gè)位點(diǎn)以下的檢測(cè)。
缺點(diǎn)：該方法需要在位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，對(duì)于位點(diǎn)的要求會(huì)較 SNaPshot 方法較高。
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改進(jìn)的連接酶檢測(cè)法（iMLDR)
iMLDR 技術(shù)是基于傳統(tǒng)的連接酶反應(yīng)經(jīng)過改進(jìn)后的多重 SNP 分型技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的連接酶反應(yīng)技術(shù)，iMLDR 提高了準(zhǔn)確性和分型的成功率，該方法的特色在于采用了一個(gè)雙連接反應(yīng)，將區(qū)分基因型的熒光使用連接方法加到連接產(chǎn)物上，這樣一來可以輕松的增加該分型方法的通量。
以下是該方法的原理圖，分型方法的原理圖上已經(jīng)描述的很清楚啦：
優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性較于 LDR 來說有了一定的提升，檢測(cè)通量較高。
缺點(diǎn)： LDR 一樣，對(duì)于位點(diǎn)的選擇性較高。
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基因芯片法
DNA 基因芯片技術(shù)是近年來新開發(fā)的一種 DNA 序列變異檢測(cè)工具，其原理是利用目標(biāo) DNA 與支持物上所固定的密集的寡核苷酸探針陣列進(jìn)行等位基因特異性反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)信號(hào)的有無和強(qiáng)弱確定 SNP 位點(diǎn)。
近年來隨著復(fù)雜性疾病研究的深入，以及可利用的基因組數(shù)據(jù)的增加，基于各種原理的 SNP 芯片反應(yīng)被開發(fā)出來，以適應(yīng)不同目的、規(guī)模和條件的基因分型，那么市面上現(xiàn)在常見的基因芯片 Illumina SNP 芯片分型平臺(tái)（包括 Infinium?技術(shù)和 GoldenGate?技術(shù)）和 Affymetrix 基因分型平臺(tái)（Affymetrix GeneTitan?技術(shù)），這兩大公司的基因分型平臺(tái)是目前應(yīng)用最為廣泛的基因分型平臺(tái)，適用于大樣本不同標(biāo)記密度的快速基因分型。
這里由于商品化芯片種類有很多，就不單獨(dú)介紹，有需要的同學(xué)可以去各家公司的官網(wǎng)上進(jìn)行查詢，這里主要介紹一下這兩家的芯片的制造區(qū)別：Illumina 的技術(shù)為微珠技術(shù)，將 DNA 探針序列偶聯(lián)到微珠的表面，再將各種微珠均勻的撒在已經(jīng)通過光蝕刻技術(shù)蝕刻出很多微孔的玻璃基片上，而 Affymetrix 的技術(shù)則是直接在玻璃載體表面通過光蝕刻的方法植上探針序列，具體的技術(shù)細(xì)節(jié)這里就不做贅述了。
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SNPSCAN 分型法
SNPSCAN 分型法采用連接酶連接反應(yīng)的高特異性實(shí)現(xiàn)對(duì) SNP 位點(diǎn)等位基因的識(shí)別，然后通過在連接探針末端引入不同長(zhǎng)度的非特異性序列以及通過連接酶加接反應(yīng)獲得位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的不同長(zhǎng)度連接產(chǎn)物，利用標(biāo)記熒光的通用引物對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，通過熒光毛細(xì)管電泳擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，最后通過 GeneMapper 軟件分析獲取各個(gè) SNP 位點(diǎn)的基因型。
以下是原理圖，幫助大家理解這種方法：
優(yōu)點(diǎn)：通量足夠大，原理上來說可以一次性檢測(cè) 48n 個(gè)位點(diǎn)。
缺點(diǎn)：對(duì)于位點(diǎn)的要求更高，比 LDR 的要求更高，因?yàn)樵摲椒z測(cè)的只有位點(diǎn)兩側(cè)的幾十 bp 序列，如果這部分的序列存在著比較特殊的結(jié)構(gòu)或者很高的同源性，那么基本可以告別這種方法了。
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